生物標(biāo)志物是指能被客觀測定及評估的，包括正常生理進(jìn)程、致病過程及介入治療后藥理學(xué)響應(yīng)的特征性指標(biāo)，如脈搏、體溫、血壓、內(nèi)源性化合物等。其中內(nèi)源性化合物可以是小分子化合物( 如部分有機(jī)酸、激素等) ，也可以是大分子化合物( 如 DNA/ＲNA、蛋白質(zhì)等) 。這類化合物在基礎(chǔ)環(huán)境中以特定的濃度存在，當(dāng)有干擾時(shí)，其濃度水平可能發(fā)生改變。它們可能是涉及信號通路、酶促反應(yīng)鏈( 如代謝途徑) 的某些物質(zhì)。
 

通常情況下，生物標(biāo)志物在體內(nèi)的濃度是其形成和消除達(dá)到動態(tài)平衡時(shí)的結(jié)果。通過對某些內(nèi)源性生物標(biāo)志物的測定，可獲知機(jī)體當(dāng)前所處的生理學(xué)狀態(tài)，這對于某些相關(guān)疾病的診斷、預(yù)防及治療過程具有監(jiān)控與輔助等作用。目前，尋找及發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的生物標(biāo)志物已經(jīng)成為生物學(xué)研究的重要熱點(diǎn)之一?；|(zhì)效應(yīng)是由與分析物共流出的其他內(nèi)源性物質(zhì)( 例如鹽類、胺類、脂肪酸、甘油酸酯等) 造成的影響或干擾。這些物質(zhì)與分析物共流出至噴霧針可能會影響待分析物的霧化、揮發(fā)、裂分、化學(xué)反應(yīng)及帶電過程，導(dǎo)致進(jìn)入質(zhì)譜的離子減少( 離子抑制) 或增多( 離子增強(qiáng)) ，從而影響定量結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性?，F(xiàn)

階段 LC － MS /MS 法定量測定內(nèi)源性物質(zhì)存在兩大難點(diǎn)，一方面由于未知量的內(nèi)源性物質(zhì)已在基質(zhì)中存在，導(dǎo)致了定量過程中空白基質(zhì)難以獲取; 另一方面，由于 一 些 內(nèi) 源 性 物 質(zhì) 含 量 極 低，有 些 甚 至 低 于LC － MS方法的定量下限。為解決這兩方面難題，科學(xué)家們作出很多努力。

近年來檢測生物樣品內(nèi)源性成分的定量方法，包括背景差減法、標(biāo)準(zhǔn)加入法、替代基質(zhì)法及替代待測物法，同時(shí)對含量較低的內(nèi)源性成分進(jìn)行測定時(shí)所用的化學(xué)衍生化-LC － MS 法進(jìn)行介紹，并通過研究實(shí)例加以闡述，以期為 LC － MS /MS 法檢測內(nèi)源性成分提供參考。

 

1 內(nèi)源性成分測定的方法

內(nèi)源性成分物質(zhì)檢測中存在的最常見的難點(diǎn)是基質(zhì)效應(yīng)的考察，目前較常使用的方法主要有背景差減法、標(biāo)準(zhǔn)加入法、替代基質(zhì)法及替代待測物法。
 

1． 1 背景差減法 背景差減法
是指從所添加標(biāo)準(zhǔn)品的濃度中減去基質(zhì)中分析物的內(nèi)源性背景濃度，隨后使用相減的濃度來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。該方法中，分析物及標(biāo)準(zhǔn)曲線具有相同的基質(zhì)，因此兩者具有相同的回收率及基質(zhì)效應(yīng)。但為保證方法的重復(fù)性，在基質(zhì)中添加已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品后引起峰面積增大的幅度比未添加前的峰面積應(yīng)滿足方法中對重復(fù)性的限度要求( 如 15% ～ 20% ) 。因此，方法的定量下限( LLOQ)是由用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所用批次基質(zhì)中的內(nèi)源性分析物濃度決定的，有別于傳統(tǒng)意義上的 LLOQ 是由MS 信噪比為 10 時(shí)的濃度。但在實(shí)際運(yùn)用中，若方法所需的 LLOQ 比基質(zhì)中內(nèi)源性分析物的濃度要低，可在加入標(biāo)準(zhǔn)品之前對基質(zhì)進(jìn)行稀釋，而后加入較低濃度的對照品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但如此操作后就意味著待測樣品與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的基質(zhì)存在差異，所以需要對基質(zhì)稀釋前后的提取回收率進(jìn)行考察對比。另一方面，加入基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度較低時(shí)，可能會引起樣品的不穩(wěn)定。當(dāng)加入的 2 － 花生基甘

油醚及血栓素 B2 質(zhì)控( QC) 樣品的濃度為 1． 3 ng /ml時(shí)，日內(nèi)變異系數(shù)( CV) ＞40%，當(dāng)加入濃度為 20 ng /ml時(shí) CV 均 ＜20%。
 

1． 2 標(biāo)準(zhǔn)加入法 標(biāo)準(zhǔn)加入法的應(yīng)用主要分為兩類: 一類是制備不含分析物的空白基質(zhì)，前提是基質(zhì)中所含分析物的濃度非常低( 一般在 LLOQ 的 20% 以下) ，也可通過某些方式( 如活性炭吸附等) 使得空白基質(zhì)內(nèi)的分析物濃度達(dá)到預(yù)設(shè)要求。另一類是在相同基質(zhì)中加入分析物從而計(jì)算出內(nèi)源性化合物的濃

度。

1． 3 替代分析物法替代分析物研究中，由穩(wěn)定同位素標(biāo)記物作為分析物替代物參與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及定量的過程。因該方法的基質(zhì)中缺少內(nèi)源性成分的干擾，故可對替代分析物進(jìn)行直接且靈敏的定量。另外，同位素標(biāo)記物與分析物除分子量有差異外，假定其余理化性質(zhì)均類似，因此它們具有相同或者類

似的提取回收率、色譜保留行為及信號響應(yīng)。但是實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)，同位素對照品與未標(biāo)記分析物通常在保留時(shí)間及 MS 靈敏度方面略有差異。因此在實(shí)驗(yàn)前，必須對標(biāo)記物及未標(biāo)記物的 MS 信號響應(yīng)比值進(jìn)行測定，其值需在整個(gè)校正范圍內(nèi)接近一致。若 ＲF 不為常數(shù)，則需在校正曲線的回歸方程中進(jìn)行體現(xiàn)。
 

2 小 結(jié)

內(nèi)源性生物標(biāo)志物在現(xiàn)代醫(yī)療中擔(dān)負(fù)著越來越重要的角色，故對其檢測方法的研究也逐漸凸顯出份量，內(nèi)源性生物標(biāo)志物的成功定量將對“精準(zhǔn)醫(yī)療”的發(fā)展產(chǎn)生積極的促進(jìn)作用。采用合適的樣品前處理方法及合適的測定方法對方法學(xué)的建立及良好的驗(yàn)證產(chǎn)生具有重大意義。但本文所述方法均為非直接測定內(nèi)源性物質(zhì)含量的方法，故必須對這類方法進(jìn)行較為系統(tǒng)的驗(yàn)證。由于目前暫時(shí)未有公認(rèn)、詳盡的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)和原則，故亟待通過科學(xué)家的共同努力，促進(jìn)該研究方向的發(fā)展。